4.4. BIOETICA Y REVOLUCION BIOTECNOLOGICA

4.4. BIOETICA Y REVOLUCION BIOTECNOLOGICA

BIOETICA:

En un contexto bioético quizá podría ser conveniente hacer una valoración general sobre lo que significa la introducción de genes humanos en organismos no humanos. Habría que distinguir dos situaciones diferentes: la primera, cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se hace en beneficio del propio hombre, y la segunda cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se hace exclusivamente en beneficio (o perjuicio) de este último. Desde el punto de vista bioético, la situación creada por la obtención de mamíferos transgénicos portadores de genes humanos para la obtención de proteínas terapéuticas humanas no es esencialmente nueva ya que, desde los primeros tiempos de la ingeniería genética molecular, se han introducido genes humanos en células bacterianas para obtener proteínas humanas (insulina, hormona de crecimiento, interferón, etc.). Tanto en el caso de las bacterias como de los animales transgénicos que se convierten en factorías naturales (biorreactores) de proteínas humanas, la valoración ética es positiva. En este último caso es importante señalar además que, al quedar restringida la expresión del gen humano a las células de la glándula mamaria, la fisiología y desarrollo del animal no se ven alterados y por tanto se evita cualquier daño a éste, quedando protegidos así los derechos de los animales.

En el segundo caso planteado, cuando la transferencia del transgén humano se realiza con el único propósito de influir en el desarrollo del animal, la valoración ética puede ser negativa si se producen anomalías importantes en su fisiología, como ocurrió en los cerdos que habían incorporado el gen humano de la hormona del crecimiento. Finalmente, en este contexto ¿podría decirse que algún gen humano concreto - en definitiva, un trozo de ADN - merecería un tratamiento o valoración ética diferente al resto? La respuesta lógica sería negativa, so pena de caer en una sacralización del ADN humano.

¿Cuál es la valoración ética de los xenotrasplantes? En primer lugar, habría que tener la garantía suficiente de que no hay problemas de transmisión viral. Aún sentada esta premisa, hay que reconocer que a muchas personas les repugna, en principio, la idea de que alguien pueda llevar un órgano animal. Sin embargo habría que recordar que desde hace mucho tiempo se realiza la implantación de válvulas de cerdo a personas con ciertas insuficiencias cardiacas y todo el mundo ha aceptado esta práctica médica. Por otro lado, la existencia de prótesis de material inerte (plástico, metales, etc.) podría ser igualmente rechazado y no lo es. Ciertamente, desde el punto de vista ético parece que no habría razón para rechazar los xenotrasplantes en la medicina del futuro, siempre que se solucionen todos los aspectos técnicos - que son muchos - que aún quedan por resolver

4.3. LEGISLACIÓN

4.3. LEGISLACIÓN

Herramientas Legales

• n  Agenda 21
• n  Constitución,
• n  Convenio de la Diversidad Biológica,
• n  Protocolo de Cartagena,
• n  Ley General de Salud,
• n  Ley Federal de Sanidad Vegetal,
• n  Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas,
• n  Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente,
• n  Ley de Desarrollo Rural Sustentable,
• n  [ Ley de Bioseguridad]
• n  Reglamentos
• n  Normas: FITO 056, [FITO-ECOL 200?]

Acuerdos internacionales y regulación en México sobre el uso de los OGMs

La utilización y liberación al ambiente de los OGMs, ha despertado cuestionamientos y el establecimiento de acuerdos internacionales y de legislaciones a nivel nacional, como:

•        i.          Convenio sobre la Diversidad Biológica (CDB), en vigor a partir de  1993,  entre otros se establece el compromiso del establecer un acuerdo sobre la seguridad de la biotecnología
•       ii.          Protocolo de Cartagena sobre la Seguridad de la Biotecnología del CDB, ratificado por México, entrando en vigor el 11 de septiembre de 2003. Establece el compromiso de definir regulaciones y medidas necesarias para evaluar los movimientos transfronterizos de los OGM’s.

Mediante el Protocolo de Cartagena, los países firmantes se comprometieron a establecer las regulaciones y medidas necesarias para evaluar los movimientos transfronterizos de los transgénicos que pudieran tener efectos adversos sobre la conservación y utilización sostenible de la diversidad biológica o sobre la salud humana.

4.2.5. TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE EN LA AGRICULTURA

4.2.5. TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE EN LA AGRICULTURA

COMPARACIÓN ENTRE SELECCIÓN TRADICIONAL Y MODIFICACIÓN GENÉTICA

TRADICIONAL:

• n  Se basa en cruzas controladas y selección de características de interés
• n  Limitada por relaciones de parentesco y compatibilidad
• n  Interacción de genes en un mismo linaje o contexto evolutivo
• n  Produce nuevas combinaciones de genes posibles
• n  Mantiene las tasas de evolución
• n  Se tarda entre 12 a 15 años
• n  Se “mueven” muchos genes a la vez

CON BIOTECNOLOGÍA MODERNA

• n  Se basa en selección de genes de interés e inserción de éstos en el genoma receptor
• n  No está limitada por barreras reproductivas
• n  Interacción de genes provenientes linajes muy distantes y con contextos evolutivos muy diferentes
• n  Produce nuevas combinaciones de genes posibles e imposibles
• n  Se tarda entre 3 a 5 años
• n  Altera las tasas de evolución
• n  Se insertan sólo algunos genes

4.2.4. VECTORES DE CLONACIÓN

4.2.4. VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores son unidades de ADN que se autoreplican en un microorganismo o células humanas y los cuales pueden portar fragmentos de ADN de origen diverso. El vector debe contar con los elementos que le permitan ser replicados y mantenidos por la maquinaria celular hospedadora. Los vectores son propagados en hospedadores que pueden ser células de E. coli, levadura (S. cerevisiae) o células mamíferas. Los vectores pueden ser estructuras sencillas como plásmidos o muy complejos como los cromosomas artificiales de levadura (YAC) y los cromosomas artificiales mamíferos (MAC). los vectores tienen diferente capacidad de portar longitudes variables de secuencias de ADN. Los cromosomas artificiales mamíferos se vislumbran como vectores de terapia genética de condiciones causada por genes mayores como el de la distrofina, cuya disfunción causa la distrofia muscular de Duchenne-Becker, gen que tiene una longitud de secuencia de 2.4 Mb.

CARACTERISTICAS IMPORTANTES DE UN VECTOR DE CLONACION PLASMIDICO:

• n  Necesita un origen de replicación àpropagar el plasmido y mantener a nivel de 10 a 20 copias por célula.
• n  Genes que confiere resistencia a antibióticos à permite la selección.
• n  Varias secuencias únicas de reconocimiento para diferentes endonucleasas de restricción à generar sitios por donde se puede insertar las secuencias foráneas de DNA.
• n  Tamaño global pequeño àfacilita la entrada del plasmido en la célula.

4.2.3. CLONACION DE GENES

4.2.3. CLONACION DE GENES

• Clonación celular: Clonar una célula consiste en formar un grupo de ellas a partir de una sola. En caso de organismos unicelulares como bacterias y levaduras, este proceso es muy sencillo y solo requiere la inoculación de los productos. Sin embargo, en el caso de cultivos de células en organismos multicelulares, la clonación de las células es una tarea difícil, ya que estas células necesitan unas condiciones del medio muy especificas. Una técnica útil de cultivo de tejidos utilizada para clonar distintos linajes de células es el uso de aros de clonación (cilindros). De acuerdo con esta técnica, una agrupación de células unicelulares que han sido expuestas a un agente mutagenico o a un medicamento utilizado para propiciar la selección se ponen en una alta dilución para crear colonias aisladas; cada una proviniendo de una sola célula potencialmente y clónicamente diferenciada. En una primera etapa de crecimiento cuando las colonias tienen solo unas pocas células; se sumergen aros estériles de colonia individual junto con una pequeña cantidad de tripsina. Las células que se clonan se recolectan dentro del aro y se llevan a un nuevo contenedor para que continúe su crecimiento.

• Clonación Molecular: La clonación molecular se refiere al proceso de aislar una secuencia de ADN de interés, insertarlo en un plásmido y obtener múltiples copias de ella en un organismo (generalmente procariota) por acción de la DNA polimerasa. La clonación se emplea frecuentemente para amplificar fragmentos de ADN que continenen genes, un paso esencial en el análisis subsecuentes. Frecuentemente, el termino clonación es erróneamente utilizado para referirse a la identificación de una localización cromosómica de un gen asociado con un fenotipo particular de interés, como la clonación posicional en la practica, la localización de un gen en un cromosoma o región genómica no necesariamente habilita para aislar o amplificar la secuencia genómica de interés.

4.2.2. ENZIMAS DE UNIÓN

4.2.2. ENZIMAS DE UNIÓN

Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados. Los extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.

4.2.1. ENZIMAS DE CORTE

4.2.1. ENZIMAS DE CORTE

Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación

Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte. La función de las enzimas de restricción es la proteger al organismo de DNA extraño. Cuando una porción de DNA foráneo ingresa a la célula, las enzimas de restricción se encargan de degradarlo cortándolo en pequeños fragmentos, siempre y cuando éste no esté modificado. Actualmente se conocen unas 200 enzimas de restricción (las más conocidas se muestran en la tabla 1), las cuales se nombran de acuerdo al organismo del cual se extraen, como por ejemplo EcoRI y EcoRII, que se extraen de E. coli o HaeIII que se extrae de Haemophilusaegyptius. Una característica de las enzimas de restricción es el reconocimiento de secuencias palindromicas. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).

Enzima de restricción	Organismo de donde se extrae
EcoRI	Escherichiacoli
EcoRII	Escherichiacoli
HindII	Haemophilusinfluenzae
HindII	Haemophilusinfluenzae
HaeIII	Haemophilusaegyptius
HpaII	Haemophilusparainfluenzae
PstI	Providencia stuartii
Mayi	Serratiamarcesens
BamI	Bacillus amyloliquefaciens
BglII	Bacillusglobiggi

4.2. CORTE Y UNION DE MOLÉCULAS DE ADN

4.2. CORTE Y UNION DE MOLÉCULAS DE ADN

¿Cómo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares: enzimas de restricción

En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas -las enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como "tijeras moleculares", cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniería genética. Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño. A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción mediante metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo específico de ciertos nucleótidos. Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de un "pegamento molecular": la enzima ligasa). Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena complementarios entre sí. Por otro lado, los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena. Las enzimas de restricción permiten cortar el genoma de cualquier organismo en pequeños fragmentos llamados fragmentos de restricción. La colección de miles o millones de estos fragmentos se llama biblioteca génica.

¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?

Una vez que los biólogos encontraron cómo fabricar ADN recombinante usando enzimas de restricción y ligasas, el desafío siguiente fue cómo producir grandes cantidades de genes y cómo introducirlos en bacterias u otras células huésped. El primer problema fue solucionado con el uso de plásmidos, pequeñas moléculas de ADN circular presente en muchas bacterias.

Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso consta de las siguientes etapas:

1. 1.  Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos cohesivos.
2. 2.  Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse.
3. 3.  Unimos el gen que queremos introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-ligasa y luego introducimos el plásmido con inserto en bacterias.
4. 4.   Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán.

4.1. TRANSFORMACIÓN DE ORGANISMOS

4.1. TRANSFORMACIÓN DE ORGANISMOS

Hemos modificado genéticamente, a lo largo de cientos de años, las especies que utilizamos para alimentación, y hasta hace poco sin conocer la estructura del ADN, utilizando mutágenos que se sabe generan múltiplescambios en los genomas de los organismos. Sin embargo, estas técnicas originales de mutagénesis y los organismos generados, no se cuestionan como los transgénicos, cuando en el fondo hoy sabemos que los métodos usados previamente generan cambios mucho más amplios en el genoma de estos organismos. La razón de la falta de cuestionamiento es, probablemente, la ausencia de daño por estos organismos altamente modificados, desde el punto de vista genético. Cabe enfatizar que la combinación de diferentes especies no surgió con los experimentos de ADNr, sino con la generación de variedades vegetales, los primeros registros sobre manipulación de plantas datan de 1919, cuando se reportaron las primeras plantaciones con semillas híbridas, desarrolladas a partir de plantas de maíz. Esta metodología permitió el aumento en 600% de la producción agrícola, en un período de aproximadamente 55 años (INIA, 2006).  Por otro lado, las mutaciones genéticas para el mejoramiento de los cultivos agrícolas -realizadas en los últimos 70 años- con técnicas de mutagénesis, han generado más de 2200 variedades vegetales, las cuales han sido poco estudiadas y hasta el momento, no se han reportado efectos adversos.

El genoma de organismos superiores ha evolucionado incrementando parte de su material genético a través de infecciones virales, y probablemente de material genético proveniente de microorganismos que hayan infectado a nuestros antepasados; incorporándose así parte del material genético del organismo que infecta en el genoma de las células receptoras. Se ha dado, mediante la endosimbiosis, la incorporacion de  material genético en etapas tempranas de la evolución de las células precursoras de los animales y plantas, a través de la infección o asociación  con precursores de los actuales organelos celulares, que son similares a las bacterias, como es el caso de la mitocondria. Además, en las plantas, los cromosomas vegetales contienen un gran número de genes provenientes de las bacterias fotosintéticas que dieron origen a los cloroplastos. En nuestro genoma y en el de todos los organismos vivos hay material genético repetido, probablemente de origen bacteriano o viral, llamado “transposones” que representa al menos 30% del genoma humano. En el maíz los transposones constituyen 85% de su genoma. Los transposones son secuencias de DNA que pueden translocar su posición en el genoma, es decir pueden “brincar” de un lugar a otro, inclusive entre cromosomas, por lo que han jugado y siguen jugando un papel importante en la reorganización y evolución del genoma. En el maíz, los granos de colores diferentes en una mazorca son resultado de este tipo de fenómeno que ocurre en un mismo individuo.

Otro tipo de material repetido en nuestro genoma, es el “retroviral” (el retrovirus es un tipo de virus que tiene su genoma de ARN). Este tipo de material repetido probablemente se estabilizó en nuestro genoma y/o en el de nuestros precursores biológicos, mediante mecanismos de infección y posterior incorporación del genoma viral al nuestro o al de nuestros predecesores. Este es otro tipo de transferencia horizontal que influye diariamente en la dinámica y reorganización del genoma. Cuando se construye un organismo genéticamente modificado o transgénico independientemente de los métodos utilizados (transformación, biobalística o electroporación que per se no afectan el genoma de la célula receptora) se introduce, a través del fenómeno de transferencia horizontal del ADN, material genético específico (transgene) a una célula. Posteriormente mediante el fenómeno de recombinación genética, el transgene es incorporado como un segmento del material genético de la célula receptora en alguno de sus cromosomas. Si en este evento -que es, de facto, una reorganización del genoma- se afectara una función codificada en el cromosoma que resultara vital para la célula, ese organismo transgénico en particular no sobreviviría. El mismo tipo de evento podría suceder en el caso de una reogarnización natural del genoma cuando es infectado por un retrovirus -el VIH causante del SIDA por ejemplo-  o afectado por un transposón que cambia su posición, ya que debido a estos fenómenos pudiera ocurrir la inserción de su material genético en un locus esencial y que por ello, la célula receptora en la que ocurriera el arreglo, no sobreviviría. Luego, la incorporación y reorganización de material genético en un genoma es un proceso natural que ocurre diariamente en la naturaleza, independientemente de los transgénicos.

UNIDAD IV: ADN RECOMBINANTE

UNIDAD IV: ADN RECOMBINANTE

El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos de especies diferentes que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo, se produce una modificación genética que permite la adición de un nuevo ADN al organismo, conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos. La producción de unaproteína no presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman proteínas recombinantes.

El ADN recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan para manipular las moléculas de ADN y difiere de la recombinación genética que ocurre sin intervención dentro de la célula. El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresión de un gen, para producir proteínas en el tratamiento de una enfermedad genética, vacunas o con fines económicos y científicos.

2.1.4.3.MATERIALES INERTES Y GELIFICANTES

2.1.4.3.MATERIALES INERTES Y GELIFICANTES

Agentes solidificantes

Su agregado al medio de cultivo es opcional.

El más usado:

-        El agar, es un  polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en pequeñas concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de composición química estrictamente definida destinados a autotrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo complejos para quimioorganotrofos.  Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia sólida normal, al 0.2-0.3% en medios semisólidos o blandos, al 5% en medios de consistencia muy firme para detener el crecimiento de gérmenes muy móviles, y al 0% cuando se preparan medios líquidos (caldos).

Sus características:

-         Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.

-       A 45-55°C se pueden agregar suspensiones de células sin afectar la viabilidad (supervivencia) de las mismas.

-      Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la mayoría de las bacterias patógenas del hombre.

-            No es tóxico para las bacterias, ni es degradado por éstas.

-          Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula), lo que resulta imposible en medios líquidos!

-            Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.

-         Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para permitir la difusión de los nutrientes del medio de cultivo en todas direcciones, y suficientemente cerrada –según la concentración empleada- para impedir la movilidad de los microorganismos.

Otros solidificantes:

-            Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa intensamente para fines específicos en Inmunología y Biología Molecular.

-            Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de cultivo para autotrofos, cuando debe excluirse materia orgánica del medio de cultivo.

-            Gelatina: es una proteína obtenida por hidrólisis del colágeno. Fue el primer solidificante usado en Microbiología, pero es degradado por la mayoría de las bacterias (lo comen, por lo que el medio inicialmente sólido termina convertido en medio líquido) y la temperatura de incubación no puede ser mayor a 22°C (es el punto de fusión) con lo que cultivos sólidos a temperaturas más altas resultan inviables.

-            Albúmina de huevo, suero: a 80°C estas proteínas coagulan y solidifican el medio de cultivo.

http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=componentes%20del%20medio%20de%20cultivo&source=web&cd=2&cad=rja&ved=0CCUQFjAB&url=http%3A%2F%2Fbd.unsl.edu.ar%2Fdownload.php%3Fid%3D281&ei=QCN6UMXlOIS1rQGVv4HwAg&usg=AFQjCNFw3VnvYBfME7A9QOw_yAsOQ7SFiA

El gelificante suele ser un sólido que al añadirse a un medio de cultivo se disuelve por calentamiento fuerte (cercano a los 100 ºC) y hace que el medio adquiera la consistencia de gel al enfriarse a temperaturas menores. Uno de los mejores agentes gelificantes de que se dispone para realizar cultivos in vitro de tejidos vegetales es el agar, también conocido como agar-agar. Los gelificantes deben cumplir con una serie de requisitos: no ser asimilado por el explanto, lo que haría que al consumirse el medio retornase a su estadio líquido, no interferir en la absorción de los nutrientes del medio de cultivo, y permanecer estable durante el tiempo de cultivo.

El agar es un polisacárido natural no ramificado y de alto peso molecular (3.000 a 160.000), extraído de algas rojas, Rhodofíceas, principalmente del género Gelidium. Está formado por galactosidos que forman la Agarosa, y de un polisacárido sulfatado, la Agaropectina. Además, contiene muy pequeñas cantidades de cationes como impurezas (Na, K, Ca, Mg, etc.). Su composición varía ligeramente en función de la especie de que se extrae, su procedencia, época de cosecha, madurez del alga, etc. Los procesos de obtención y purificación para producir los distintos tipos de agar afectan principalmente a su contenido en impurezas.

La principal característica que hace del agar un gelificante es su total disolución en agua al ser calentado a 85-100 ºC, y su gelificación alrededor de los 35 ºC. Es termoreversible, es decir, se puede volver a disolver y a gelificar repetidas veces mediante variaciones en la temperatura, y es autoclavable. Su gelificación depende del pH del medio de cultivo, siendo óptima para pH 5.4-5.7. Los medios de cultivo para tejidos vegetales suelen ajustarse a pH = 5.7 antes de añadir el agar, por lo que melifican bien; tras la gelificación el agar absorbe una cantidad de agua de hasta 200-300 veces su peso, y forma un gel muy translúcido. La preparación de los medios de cultivo para vegetales incluye generalmente un aporte de agar del 0.8%.

Entre los compuestos alternativos al agar para utilizarse como gelificantes en el cultivo in vitro de tejidos vegetales tenemos:

• Alginatos. Excelentes para cultivo de células en suspensión y de protoplastos.

• Agarosa. Es uno de los polímeros del agar, obteniéndose a partir de él. Se utiliza más en electroforesis de proteínas o ácidos nucleicos que en cultivo in vitro.

• Fitagel. Conocido también con el nombre gelrita, marca registrada de Merck; es de amplio uso.

• Ficoll. Es un derivado de polisacáridos que produce medios de cultivo de tipo coloidal. Encuentra una aplicación importante en el cultivo de anteras.

El fitagel es un polisacárido aniónico obtenido por fermentación bacteriana. El gel que forma se caracteriza principalmente por:

• Gran transparencia, que facilita el seguimiento del cultivo.

• El medio nutritivo se gelifica con un aporte de fitagel de tan sólo el 0.2%

• Precisa de cationes divalentes para su gelificación, principalmente Mg o el Ca.

• Se disuelve y gelifica en respuestas a cambios de temperaturas, como el agar, si bien no es termoreversible.

• Los explantos cultivados en medios con fitalgel absorben los nutrientes con mucha facilidad, lo que permite un crecimiento mas rápido, sin embargo la velocidad de absorción puede ser excesiva, no pudiendo incorporarse a sus estructuras y compuestos sino que quedarían en solución dentro del explanto, causando el problema conocido típicamente como hiperhidricidad, frecuente en cultivos de tipo leñoso.

•Su coste es mucho menor.

2.1.4.2. COMPUESTOS ORGANICOS

2.1.4.2. COMPUESTOS ORGANICOS

Factores de crecimiento

Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por la célula que los necesita. Por esta razón, deben ser agregados al medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B, algunos aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos. Hay ejemplos clásicos como los factores X y V (porfirinas) de la sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos factores de crecimiento, es imprescindible para el cultivo de células animales.

Cómo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La capacidad de sintetizar un compuesto esencial está relacionada con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genéticas, alguna enzima de la secuencia no puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea en algún paso y no finaliza con éxito. El compuesto que por esta razón dejó de sintetizarse, se convierte en un factor de crecimiento.

** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los factores de crecimiento pueden ser aportados por diversos extractos:

-Extracto de carne: su función es ser complemento vitamínico de las peptonas. Pero también aporta sustancias nitrogenadas como:  aminoácidos, bases púricas y pirimídicas, ácidos orgánicos, creatina, xantina, hipoxantina, ácido úrico, urea, y sustancias no nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de hexosas, ácido láctico, sales inorgánicas.

La calidad de este tipo de extracto varía con la carne empleada, el tiempo y la temperatura de extracción.

-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de las células de levadura. Su función es sersuplemento vitamínico de las peptonas, pero también aporta mezclas de aminoácidos y péptidos, y carbohidratos.

-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de levadura ya que posee adecuado contenido de vitaminas, carbohidratos y aminoácidos. Es el extracto soluble en agua de la malta de cebada.

2.1.4.1. COMPUESTOS INORGANICOS

2.1.4.1. COMPUESTOS INORGANICOS

Elementos energéticos y constitutivos:

a) Macroelementos (g/l):

• Fuente de carbono: puede ser CO₂ ó compuestos carbonados orgánicos. Se utilizan en la construcción de innumerables moléculas necesarias para la célula. Los hidratos de carbono se consideran fuente de carbono y energía por excelencia en los quimioorganotrofos. Los más comunes son:

-         hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;

-         pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;

-         disacáridos como lactosa, sacarosa, maltosa;

-         trisacáridos como rafinosa;

-         polisacáridos como almidón, glucógeno;

-         alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y

-         glucósidos como salicina, y esculina.

• Fuente de nitrógeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la fuente de nitrógeno y pueden crecer utilizando moléculas sencillas como NO₃^-, NH₃ ó N₂. El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar nitrógeno en forma de aminoácidos, bases púricas o pirimídicas.

** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de nitrógeno es realizado por las peptonas, que son los productos de la hidrólisis ácida o enzimática de proteínas de origen animal o vegetal (carne, soja, caseína, gelatina, harina de maíz y girasol). Esos productos de hidrólisis pueden tener longitud variable, desde aminoácidos, hasta dipéptidos, tripéptidos, polipéptidos, albumosas, proteosas.

La hidrólisis ácida puede ser realizada con HCl ó H₂SO₄ y presenta las siguientes desventajas:

-            el triptofano se destruye

-            se pierde el 10% de vitaminas presentes

-            desaparecen casi completamente los polipéptidos

Se prefiere la hidrólisis enzimática que emplea diferentes proteasas actuando a pH específicos, ej. papaína a pH 6.5, tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.

Las peptonas son fuente de nitrógeno y, en ausencia de hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo, cumplen la función de fuente de carbono y energía. Aportan vitaminas del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan carácter “buffer” al medio.

Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos fermentables.

• Fuente de fósforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que también confieren poder buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolípidos de la yema. El fósforo se incorpora a ácidos nucleicos, fosfolípidos, polímeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva (gránulos de volutina)
• Fuente de azufre: se adiciona como SO₄⁼, cisterna o metionina. En la célula se incorpora a aminoácidos y diferentes coenzimas.
• Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y magnesio se adicionan como sales inorgánicas. Son cationes que estabilizan macromoléculas aniónicas. K⁺ actúa como coenzima y estabilizador de RNA. Mg²⁺se integra a colorofila en organismos fotosintéticos. Ca²⁺ abunda en esporas como dipicolinato de calcio.
• Fuente de sodio: sodio contribuiría a equilibrar la presión osmótica del medio extracelular. Es un catión requerido por bacterias halofílicas. Se suele suministrar como NaCl.

   

      b) Microelementos o trazas (mg ó ug/ml): suelen estar naturalmente presentes como contaminantes de los macroelementos.

       *  Frecuentemente esenciales:

          Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulación.

          Fe: cofactor de enzimas para la función respiratoria en citocromos, catalasa y flavoproteínas. En adecuada concentración favorece la síntesis de toxina diftérica.

          Co: interviene en la síntesis de vitamina B₁₂.

          Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria.

• Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be, F, etc.
• Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor que 10^{-4 Mpuede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.}  

2.1.4. COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

2.1.4. COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

Como ya se ha señalado, la provisión de elementos nutritivos en concentración adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hábitat natural.

La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el pH, la fluidez y la presión osmótica que se le quiera brindar a los microorganismos. En función de la consistencia se puede clasificar a los medio el líquidos y sólidos. En el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida, en cuyo caso se los denomina caldos, o en forma sólida si se le agrega agar al caldo. En cuanto a la esterilización, este procedimiento garantiza la destrucción de todos los microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparación del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al autoclave (121 ºC, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibióticos y compuestos fácilmente oxidables al calor, se los esteriliza por separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya enfriado a 50 ºC. 

En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los elementos citados a continuación, son los más frecuentemente usados en la preparación delos medios de cultivo, aunque pueden no ser los únicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparación.

• −      Agua destilada o desionizada:  Libre de inhibidores del crecimiento.
• −  Agar: . El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. Elcomponente dominante en el agar es un polisacárido, al que acompañan algunas impurezas yque se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua aebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelificaalrededor de los 42°C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de sersólido a la temperatura de incubación. Con la excepción de algunos microorganismosmarinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio sólido se le agregaagar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %.
• -        Extractos:  Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplocarne, hígado, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor, y posteriormente concentradohasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentementeempleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura,de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustanciasnitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminasdel grupo B, nitógeno y carbono.
• -     Peptonas: . Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales mineralesque carecen de identidad química definida; se obtienen por digestión enzimática o química deproteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muyricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas ysales. Proveen proteosas, peptonas, polipéptidos y aminoácidos.
• -  Fluidos Corporales: . Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo sonfrecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. Lasangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones asépticasdirectamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen confactores de crecimiento, sino también con sustancias que neutralizan inhibidores delcrecimiento de algunas bacterias.
• -  Sistemas amortiguadores: . Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo paramantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismosmás comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a laneutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas,previenen una desviación del pH.
• -        Indicadores de pH: Indicadores ácido- base se añaden a menudo a los medios de cultivo conobjeto de detectar variaciones del pH.
• -        Agentes reductores:  Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a losmedios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenesmicroaerófilos o anaerobios.
• -     Agentes selectivos: La adición de determindas sustancias al medio de cultivo puedeconvertirlo en selectivo (ver más adelante, clasificación de los medios de cultivo). Porejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a laconcentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinadosmicroorganismos.

COMPONENTES DE UN MEDIO DE CULTIVO SON:

• Auxinas: ácido indol-acético (IAA), ácido naftalen-acético (NAA), ácido indol-butirico (IBA), ácido 2,4-Dicloro-fenoxi-acético (2,4-D)

• Citoquininas: benciladenina (BA), quinetina (KIN)

• Giberelinas: ácido giberélico (GA3)

• Ácido abscísico (ABA)

• Otros reguladores del desarrollo vegetal

De entre ellos es frecuente la adición de auxinas y citoquininas, en diferentes proporciones en función principalmente del tipo de diferenciación a inducir y del tipo de especie a cultivar. El uso de otros reguladores es mucho más ocasional.

Hidratos de Carbono:

• Monosacáridos: glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, ribosa, xilosa

• Disacáridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa

• Trisacáridos: rafinosa

• Polisacáridos: almidón, celulosa De entre ellos el habitualmente utilizado en los medios de cultivo es la sacarosa.

Otros compuestos orgánicos:

• Aminoácidos

• Poliaminas Su utilización es diversa: para aportar una fuente suplementaria de nitrógeno en forma amina, producir procesos morfogénicos, etc. Suplementos de composición indefinida:

• Extractos de levadura, malta, carne, vegetales (patata, maíz, raíces y rizomas)

• Jugos de frutas u hortalizas (naranja, banano, piña, tomate, patata, leche de coco)

• Caseína hidrolizada Su uso es desaconsejable por no poder darse una composición precisa del extracto añadido, pueden resultar útiles sólo en casos concretos.

Compuestos específicos:

• Antioxidantes: ácido cítrico, ácido ascórbico

• Adsorbentes: carbón activo

• Controladores del potencial osmótico: polietilen-glicol, manitol Se puede precisar su aporte a los medios en condiciones concretas.